Vienas iš pagrindinių mikrobiologijos laboratorijos tikslų – apsaugoti žmones ir gyvūnus nuo susirgimų infekcinėmis ligomis. Mikrobiologinė diagnostika vis dažniau naudojama ir privačiose veterinarijos klinikose, todėl svarbu įvertinti, ar jose naudojami metodai tinkami ir patikimi.

Skiriami klasikinės ir molekulinės mikrobiologijos diagnostikos metodai. Kiekviena šių grupių turi pranašumų ir trūkumų.

Klasikinė mikrobiologija gimė XVII a., atradus pirmuosius mikroskopus, o suklestėjo XIX a., kai buvo sukurtos dirbtinės terpės, kuriose galima išauginti ligų sukėlėjus. Įdomu tai, kad būtent šiame amžiuje buvo pradėtos naudoti ir Petrio lėkštelės, ir anilino dažai, kuriais dažomi mikroorganizmai pagal Gramą. Nepaisant to, kad mikrobiologijos mokslas daugiausia atradimų padarė dar XIX a., visi jie ir šiandien yra neatskiriama klasikinės mikrobiologijos diagnostikos dalis.

Klasikinė mikrobiologija – populiariausia

Šiuolaikinė klasikinė mikrobiologija remiasi ligų sukėlėjų išskyrimu mitybinėse terpėse, jų identifikacija pagal biochemines savybes, t. y. pagal įvairių fermentų, galinčių skaidyti įvairius maisto substratus, gamybą ir jautrumo antibiotikams nustatymą.

Kodėl klasikinė mikrobiologija yra tokia populiari ir išlieka svarbiausiu bene kiekvienos mikrobiologinės laboratorijos pagrindu? Taip yra todėl, kad šiuo atveju yra išskiriami gyvi mikroorganizmai, su kuriais galima atlikti daugelį reikiamų eksperimentų, nustatant jų jautrumą antibiotikams, patogeniškumą, priklausomybę serologinėms grupėms ir tai, kad gyvi mikroorganizmai kartais reikalingi naujesniems molekulinės biologijos metodams pritaikyti.

Išskirtus mikroorganizmus galima saugoti kone neribotą laiką, juos galima naudoti įvairiais tikslais, pavyzdžiui, mitybinių terpių ar kitų testų kontrolei, iš jų galima gaminti diagnostikumus, vakcinas ar išgauti reikiamas medžiagas, kurias patys gamina gyvi mikroorganizmai. Dar vienas klasikinės mikrobiologijos privalumas yra iš dalies nedideli tyrimo kaštai, nereikia brangios papildomos įrangos.

Metodai turi trūkumų

Vis dėlto klasikinės mikrobiologijos metodai turi ir tam tikrų akivaizdžių trūkumų. Vienas didžiausių, kad kultivuojamų mikroorganizmų yra tik maža dalis, geriausiu atveju gal koks 1 proc. iš visų žinomų mikroorganizmų rūšių, todėl galimos didelės diagnostikos klaidos, kai ligos sukėlėjas terpėse neišauga. Taip galima klaidingai diagnozuoti ligą, o paskui ir skirti netinkamą gydymą. Taip pat svarbu, kad, neteisingai nustačius ligos sukėlėją arba jo neišauginus, neracionaliai bus naudojamos antimikrobinės medžiagos, t. y. nežinant tikrojo sukėlėjo sunku parinkti tinkamus antibiotikus gydymui.

Antras šių metodų taikymo trūkumas – kadangi bakterijos atpažįstamos pagal išaugusių kolonijų morfologiją, mikroorganizmų formą, kolonijų spalvą, dydį ir net būdingą kvapą, reikia patyrusio specialisto tam suprasti. Tik ilgalaikė praktika leidžia greičiau ir tiksliau identifikuoti išaugusius mikroorganizmus.

Nors klasikinė mikrobiologija pastaraisiais metais truputį patobulėjo, tačiau jos vystymasis yra labai sulėtėjęs ir naujų, kiekybiškai svarbių atradimų šioje srityje nematyti. Vienas iš palengvinimų, ką dažnai bando išnaudoti ir nedidelės veterinarijos gydyklų laboratorijos, yra vadinamosios chromogeninės terpės, kuriose skirtingų rūšių ar kitų grupių bakterijos išauga skirtingų spalvų kolonijomis, o tai leidžia lengvai ir gana patikimai identifikuoti mikroorganizmus. Tačiau reikia pabrėžti, kad tokių terpių įvairovė dar nėra didelė. Ar patikimai identifikuoti gali mažai patirties turintis darbuotojas, pavyzdžiui, veterinarijos gydytojas, duomenų yra nedaug.

Šiek tiek patobulėję ir biocheminių savybių tyrimai, kai skirtingų substratų skaldymas tiriamas patogiai komerciškai paruoštose plokštelėse ar juostelėse. Tačiau praktika rodo, kad šie patobulinimai leidžia tik greičiau atlikti darbą, bet identifikacijos patikimumas dažniausiai būna santykinai žemas, palyginti su klasikiniu, vadinamuoju „margos eilutės“ tyrimu atskiruose mėgintuvėliuose.

Sekoskaitos metodas patikimas, bet brangus

Molekulinės biologijos metodai – tai antra didelė grupė tyrimų, kuriais nustatomi ligos sukėlėjai. Vienas iš šių metodų – polimerazės grandininė reakcija (PGR), galima sakyti, jau tapo klasikiniu daugelio mikrobiologijos laboratorijų metodu. Šio metodo esmė – ieškomas konkretus ligos sukėlėjas pagal jo DNR fragmentą. Didžiausias šio metodo privalumas – greita ir labai tiksli diagnostika, gaunant atsakymą, ar tiriamoje medžiagoje yra ieškomų mikroorganizmų. Šiuo metodu galima aptikti ne tik patį mikroorganizmą, bet, pavyzdžiui, ir genus, atsakingus už atsparumą antibiotikams arba virulentiškumą.

Šio metodo trūkumas, kad vienu metu ieškomas tik vienas, kartais – keletas mikroorganizmų ar jų genų, todėl reikia iš anksto žinoti, kokio mikroorganizmo ieškome. Jei sukėlėjas yra nežinomas, ieškant kelių mikroorganizmų tarp galimų tūkstančių bakterijų rūšių juos rasti galimybių mažai, o tuo labiau negalima pasakyti, ar medžiagoje nėra kitų sukėlėjų, kurių tuo metu neieškome.

Dar vienas molekulinės diagnostikos metodas, taikomas šiuolaikinėje mikrobiologijoje, tai pirmos kartos, arba Sanger tipo (pavadinta pagal atradėjo pavardę) sekoskaita. Turint išskirtą nežinomą mikroorganizmo kultūrą, ją galima identifikuoti atliekant sekoskaitą pagal šį metodą – nuskaitę tam tikrą specifinį bakterijoms DNR fragmentą ir palyginę jį su duomenų bazėse esančiais pavyzdžiais, galime bent iki genties lygmens patikimai nustatyti mikroorganizmą. Didžiausias metodo privalumas – bet kokio nežinomo organizmo atpažinimas, o trūkumas – brangi sekoskaitos įranga ir reikalingi papildomi tyrimai (mikroorganizmo išauginimas, PGR atlikimas).

Naujos kartos sekoskaita pateikia daug atsakymų

LSMU Veterinarijos akademijoje, be jau minėtų mikrobiologinės diagnostikos metodų, šiuo metu taikomi ir patys naujausi atradimai – naujos kartos sekoskaita. Ši sekoskaita gali būti naudojama skirtingais tikslais, iš kurių pagrindiniai yra trys.

Pirmu atveju galima nuskaityti visą tiriamo mikroorganizmo DNR grandinę ir gauti išsamią informaciją apie jį (priklausomybė rūšiai, porūšiui ar variantui, genai, koduojantys atsparumą antibiotikams, patogeniškumą lemiantys genai, mutacijos). Šis metodas dažniausiai taikomas arba siekiant nustatyti per epidemiją cirkuliuojančio mikroorganizmo priklausomybę tam tikram tipui (atsekti epidemijos ar maisto sukeltos infekcijos konkretaus mikroorganizmo plitimą), arba norint gauti kuo išsamesnių žinių apie mikroorganizmą. Paprastai tokių žinių reikia charakterizuojant gamybines mikroorganizmų padermes, tokias kaip probiotikai, vakcininės padermės ar maisto technologijose naudojami mikroorganizmai, kad būtų galima įvertinti, ar jie neturi atsparumo antibiotikams genų ir nesukels susirgimo.

Antrasis naujos kartos sekoskaitos pritaikymas yra susijęs su mikrobiomo tyrimais. Tai toks tyrimas, kuris leidžia nustatyti visus tiriamos karalystės (pvz., bakterijų arba grybų) atstovus, pagal jų kiekį ir taksonominę sudėtį tiriamoje aplinkoje. Paprastai joje yra daug mikroorganizmų, tai gali būti virškinamojo trakto dalys, išmatos, burna, dirvožemis, vanduo ir kt.

Šio metodo esmė – vienu metu atliekama daug sekoskaitų, panašių į pirmo tipo (Sanger) sekoskaitą, tiriant kone kiekvieno mėginyje esančio mikroorganizmo specifinę karalystei DNR grandinės dalį. Tai labai naudingas tyrimas, siekiant nustatyti mikrobiotos pokyčius virškinamajame trakte, keičiant pašarų sudėtį, įterpiant įvairius priedus ar pan., ir stebint, kaip toks pašaras veikia gerųjų ir blogųjų mikroorganizmų santykį.

Trečias naujos kartos sekoskaitos metodas, kurį taip pat jau yra įvaldę Veterinarijos akademijos mokslininkai – vadinamoji „shotgun“ tipo sekoskaita, per kurią viename mėginyje galima itin tiksliai nustatyti tiriamų mikroorganizmų rūšį ir net padermę, mėginyje esančių mikroorganizmų genus, atsakingus už atsparumą antibiotikams ir patogeniškumą bei išaiškinti funkcinius genus.

Universalus metodas dar nesukurtas

Pastaruoju metu didelis dėmesys kreipiamas į atskirų organizmo sistemų ir bakterijų ryšį, t. y. kokią įtaką bakterijos daro mūsų organizmo funkciniams ir galbūt net elgesio ypatumams. Šioje srityje laukia didelis proveržis, nes dar mažai išaiškinta, kiek mes, žmonės ar gyvūnai, esame priklausomi nuo tų, kurie gyvena mumyse, ir kurių yra milijardai. Kitaip sakant, žmogaus ar gyvūno organizmas yra ištisa mikroorganizmų planeta. Mikroorganizmai neabejotinai mums daro įtaką, kurią lemia milijonus metų trunkantys evoliucijos ryšiai tarp mikroorganizmų ir gyvūnų.

Nepaisant to, kad molekulinė biologija ypač sparčiai vystosi, teikia naujas galimybes, reikia vertinti ir trūkumus, kurių diagnostikos metodai dar kol kas turi.

Pagrindiniai paminėtini trūkumai – didelė kaina, per tyrimą neišskiriami gyvi mikroorganizmai, su kuriais galima būtų atlikti papildomus tyrimus, ne visais atvejais, nustačius atsparumo antibiotikams genus, galima pasakyti, kuriam konkrečiam mikroorganizmui priklauso šie genai, ar jie aktyviai veikia, ar ne.

Taigi, viską sudėjus aišku, kad šiandien dar neturime vieno ir universalaus mikrobiologijos diagnostikos metodo, kad yra skirtingų tyrimų su savo privalumais ir trūkumais, ir kad juos parinkti gali kvalifikuotas mikrobiologas. Todėl nereikėtų pernelyg pasitikėti ar žavėtis veterinarijos gydyklose atliekamais mikrobiologiniais tyrimais, kurie dažnai būna dar labiau supaprastinti. Ir nors iš pirmo žvilgsnio gali pasirodyti patogūs, tačiau jų galimybės ir, svarbiausia, patikimumas, nėra toks, kaip specializuotose laboratorijose.